ОПТИМІЗАЦІЯ ПАРАМЕТРІВ ВІДМИВКИ БАКТЕРІАЛЬНИХ КЛІТИН ТА ТІЛЕЦЬ ВКЛЮЧЕННЯ У ВИРОБНИЦТВІ РЕКОМБІНАНТНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ
DOI:
https://doi.org/10.20998/2078-5364.2025.4.08Ключові слова:
рекомбінантний інсулін, біопроцеси, оптимізація, сепарація, культура бактеріальних клітин, тільця включення, відмивкаАнотація
В роботі представлено результати досліджень оптимізації параметрів процеси відмивки бактеріальних клітин штаму генно-модифікованого штаму-продуценту рекомбінантного інсуліну людини на основі Escherichia coli BL21 від компонентів культурального середовища та відмивки виділених в результаті руйнування зазначених бактеріальних клітин тілець включення від компонентів цитоплазми й клітинного дебрісу. Обгрунтовано доцільність досліджень щодо технологічності, виходу та якості очищення цільового продукту на подальших етапах даунстрім-процесу біотехнологічного виробництва рекомбінантного інсуліну людини. В результаті проведених досліджень показано, що діапазони швидкості подачі суспензії на відцентровий сепаратор з автоматичним вивантаженням 300–650 л/г та часу між вивантаженнями 250–350 С за максимальної швидкості обертання барабану 11700 об/хв визначають напрям оптимізації параметрів відцентрового розділення. В процесі оптимізації визначено потенційну причину виникнення високих пускових струмів мішалок в реакторах під час відмивки та розчинення гібридного білку перед рефолдінгом. Запропоновано альтернативні рішення зазначеної проблеми: використання ДНКази під час відмивки суспензії тілець включення або використання нового, потужнішого обладнання, конструкція якого враховує можливість виникнення високих пускових струмів. Результати досліджень дозволили запропонувати кореляцію порядків величин нормалізованої відмінності між значеннями в’язкості суспензій та вмістом в них сухого залишку для впровадження в якості індикатору якості концентрування тілець включення для контролю біопроцесу. В модельних експериментах досліджено вплив ПАР під час відмивки тілець включення на повноту видалення нуклеїнових кислот, відсутність втрат продукту при відмивці, та повноту розчинення тілець включення перед рефолдінгом. Найбільший рівень повноти розчинення (83,21 %) встановлено після відмивки тілець включення розчином ПАР ROKwinol80. Результати досліджень окреслити простір дизайну оптимальних параметрів відцентрового розділення відповідно до фактичних виробничих умов. За результатними оцінювання параметрів в’язкості технологічних середовищ запропоновано гіпотезу та потенційні шляхи оптимізації параметрів експлуатації ємнісного обладнання. Сформовано перспективні напрямки подальших досліджень щодо кількісного аналізу впливу ПАР на видалення нуклеїнових кислот та застосування специфічних ферментів для їх гідролізу у складі відмивочних розчинів.
Посилання
Baeshen M., AlHejin A. M., Bora R. S., Ahmed M. M. M., Ramadan H. A. I., Saini K. S., Baeshen N. A., Redwan E. M. Production of biopharmaceuticals in E. coli: current scenario and future perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2015. Vol. 25. P. 953-962.
Niazi S. K., Magoola M. Advances in Escherichia coli-Based Therapeutic Protein Expression: Mammalian Conversion, Continuous Manufacturing, and Cell-Free Production. Biologics. 2023. Vol. 3, No. 4. P. 380-401. DOI: https://doi.org/10.3390/biologics3040021.
Cardoso V. M., Campani G., Santos M. P., Silva G. G., Pires M. C., Gonçalves V. M., Giordano R. C., Sargo C. R., Horta A. C. L., Zangirolami T. C. Cost analysis based on bioreactor cultivation conditions: Production of a soluble recombinant protein using Escherichia coli BL21(DE3). Biotechnology Reports. 2020. DOI: https://doi.org/10.1016/j.btre.2020.e00441.
Tripathi N. K., Shrivastava A. Recent Developments in Recombinant Protein–Based Dengue Vaccines. Frontiers in Immunology. 2018. Vol. 9. Article 1919. DOI: https:// doi.org/ 10.3389/ fimmu.2018.01919.
Lagousi T., Basdeki P., Routsias J., Spoulou V. Novel Protein-Based Pneumococcal Vaccines: Assessing the Use of Distinct Protein Fragments Instead of Full-Length Proteins as Vaccine Antigens. Vaccines. 2019. Vol. 7, No. 1. Article 9. DOI: https://doi.org/10.3390/vaccines7010009.
Keikha M., Eslami M., Yousefi B., Ghasemian A., Karbalaei M. Potential antigen candidates for subunit vaccine development against Helicobacter pylori infection. Journal of Cellular Physiology. 2019. DOI: https://doi.org/10.1002/jcp.28870.
Overton T. W. Recombinant protein production in bacterial hosts. Drug Discovery Today. 2014. Vol. 19, No. 5. P. 590–601. DOI: https://doi.org/10.1016/j.drudis.2013.11.008.
Marco A. Recent advances in recombinant production of soluble proteins in E. coli. Microb Cell Fact. 2025. Vol. 24. Article 21. DOI: https://doi.org/10.1186/s12934-025-02646-8.
Motronenko, V., Lutsenko, T., Galkin, A., Gorshunov, Y., & Solovjova, V. Optimization of the culture medium composition to increase the biosynthesis of recombinant human interleukin-7 in Escherichia coli . Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 2020. No. 9(4), P. 761–68. DOI: https://doi.org/10.15414/jmbfs.2020.9.4.761-768.
Galkin A. Biosafety Management: Emphasis on Medicine, Pharmacy, and Bio- technology. Innov Biosyst Bioeng. 2025. No. 9 (2). P. 2-3. URL: https:// ibb.kpi.ua/ article/view/329014.
Galkin O. I., Savchenko A. A., Nikitina K. I., Dugan O. M. Obtaining and study of properties of new monoclonal antibodies against human IgE. Ukrain'skyi Biokhimichnyi Zhurnal. 2013. No. 85(5), P. 81–87.
Walsh G., Walsh E. Biopharmaceutical benchmarks 2022. Nature Biotechnology. 2022. Vol. 40. P. 1722–1760. DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-022-01582-x.
Kothari M., Wanjari A., Acharya S. A comprehensive review of monoclonal antibodies in modern medicine: tracing the evolution of a revolutionary therapeutic approach. Cu- reus. 2024. Vol. 16, No. 6. Article 61983. DOI: https://doi.org/10.7759/cureus.61983.
Lee S.Y. High cell-density culture of Escherichia coli (Review). Trends in Biotechnology. 1996. Vol. 14, Iss. 3. P. 98–105.
Puzyr V. H., Krasheninin O. S., Zhovtyi Yu. V. Planuvannia eksperymentu pid chas naukovykh doslidzhen: metod. vkaz. Kharkiv : UDUZT, 2020. 55 p.
Kheilomskyi D. O., Maistrenko L. A., Mokrousova O. R. Kompleksna optymizatsiia vidmyvky bakterialnykh klityn Ta tilets vkliuchennia u vyrobnytstvi rekombinantnoho insulinu liudyny: zbirnyk tez II Mizhnarodnoi naukovo-praktychnoi konferentsii «Innovatsiini materialy ta tekhnolohii: biotekhnolohiia, prykladna khimiia, ekolohiia» (30-31 zhovtnia 2025 r., KNUTD). Kyiv : KNUTD. 2025. P. 85.
Vyrobnytstvo. PrAT «Indar». 2025. URL: https://indar.com.ua/ua/manufacture.
